LABORATORIO EVALUACION DE LA ACTIVIDAD DE CELULASA, AMILASA Y PROTESAS PRODUCIDAS POR MICROORGANISMOS  EFICIENTES PREVIAMENTE AISLADOS

Las estructuras que forman el cuerpo de los seres vivos se construye mediante reacciones químicas. Son también reacciones químicas las que fabrican las moléculas que forman esas estructuras y reacciones químicas son las que en ultimo termino dan lugar a las funciones que todo ser vivo realiza. Las enzimas son las encargadas de dirigir toda esa variedad de reacciones, hacen que ocurra la reacción necesaria en el momento adecuado y en el momento preciso.

La celulasa es una enzima compleja especializada en descomponer celulosa, transformándola en múltiples monómeros de glucosa. Es producida con leves diferencias químicas por los integrantes del reino de los Hongos y el de las Bacterias. Los cuales son los mayores descomponedores del planeta.

El almidón es un polisacárido, más específicamente un homopolisacárido de reserva energética predominante en las plantas, constituido por la unión de grandes cantidades de monómeros de glucosa.

El almidón se encuentra en los amiloplastos de las células vegetales, sobre todo en las semillas, las raíces y los tallos, incluidos los tubérculos. También aparece en algunos protoctistas.

El almidón está formado por dos compuestos amilasa y aminopectina

Las enzimas proteolíticas (comúnmente llamadas proteasas) pertenecen al grupo de Hidrolasas, ya que catalizan la degradación de otras proteínas hidrolizando los enlaces peptídicos con diferentes grados de intensidad y de selectividad. Un enlace peptídico es la unión que se realiza entre el grupo ácido de una aminoácido con el grupo amino de otro, con la consecuente eliminación de una molécula de agua.

En el laboratorio realizado, el objetivo es evaluar la producción de amilasas, celulasa y proteasas a partir de microorganismos eficientes por métodos cualitativos y cuantitativos.

Para esto, primero realizamos un laboratorio preliminar con el fin de obtener de los caldos de proteína, amilasa y almidón un cultivo, al cual se le aplico  rotación y temperatura adecuada. Para así 27 horas más tarde obtener resultados, deteniendo el proceso a diferentes horas con el fin de  comparar en tres etapas la cantidad de cada una de las sustancias.

Para lograr el objetivo de evaluar cualitativamente se utilizaron diferentes reactivos como lo fueron el rojo congo, lugol, acidotricloroacetico, reactivo de biuret y reactivo de benedict.

Rojo congo: Sal de sodio con gran afinidad por las fibras de celulosa.

Lugol: En microbiología se emplea en la tinción de Gram para retener el colorante cristal violeta. Sirve igualmente para identificar polisacáridos como los almidones, glucógeno.

Acidotricloroacetico: El ácido tricloroacético es una solución que ha bajas concentraciones precipita las proteínas, dando lugar a la aparición de un fino precipitado en suspensión.

Reactivo de Biuret: El Reactivo de Biuret es aquel que detecta la presencia de proteínas, péptidos cortos y otros compuestos con dos o más enlaces peptídicos en sustancias.

Reactivo de Benedict: identifica azúcares reductores.

Se puede observar que la amilasa fue la que obtuvo aros más grandes indicando que es la que mayor cantidad de encima tenía en ese momento, esto se logro mediante la reacción con el lugol produciendo azúcar reductor (glucosa)

En la proteasa se adiciona  2 gotas de acido acético y produjo aminoácidos libres pero la cantidad de enzima que se produjo no es muy alta ya que los aros creados alrededor no son  grandes.

A la celulasa se agrego carboximetil celulosa, creando zonas claras alrededor  (monosacáridos).

Luego de realizar este proceso se utiliza el tubo de Mac farland para obtener  datos cualitativos, con este se compara el patrón de turbidez que sería          1x106 ml. Para realizar esta prueba se  toma un tubo con agua destilada estéril, este se debe llevar a la misma turbidez, de esta forma se tiene el estimado, a esta le agrego 1ml a cada caldo según corresponda.

Posteriormente se lleva al cheiquer con rotación 72 revoluciones por minuto durante 27 horas, así se crea burbujeo que  permitirá determinar por métodos bioquímicos y colorimétricos la producción de azucares reductores.

Luego de separar las muestras por horas 5, 8 y 27 se realiza la prueba de identificación de hidrólisis sembrando en superficies de petri 1mil de cada muestra así obtendremos Nf = unidades formadores de colonias asi llegando hasta la cantidad de generaciones.

Se conformaron tres grupos, cada uno con la muestra de diferentes horas que anteriormente habían sido incubadas por 24 horas, cada grupo utilizo 3 tubos de ensayo por componente sembrando 0.1ml en 9ml de agua peptonada haciendo diluciones de 10-3 agitando correctamente.

De la muestra anterior se tomaron 2ml de cada uno, al almidón se le agrego 6 gotas de benedit a la proteína se le agrego 6 gotas de biuret y a la celulosa se le agregaron 6 gotas de glucosa.

En el grupo de las 5pm no se obtuvo hidrólisis solo de la proteasa, en el grupo de las 6:50am ya se obtuvo hidrólisis de todas las muestras aunque no era la más eficiente mientras que en el grupo de las 9:25 am si se obtuvo una total hidrólisis de todas las muestras esto se vio reflejado en el color que se obtuvo.

Estos mismos resultados se ven reflejados matemáticamente gracias a la formula Nf=Ni x 2’n, para la cual es necesario hacer recuento o crecimiento.

Existen diferentes métodos para evaluar y cuantificar el número de individuos, tales como:

Métodos directos: Cámara de recuento de Petroff-Hauser  y Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter).

Método indirecto: Recuento de viables en placa y Recuento sobre filtros.

Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

Ø	Ø  excavación con 0.02 mm de profundidad.
Ø	Ø  área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes.
Ø	Ø  cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.
Ø	Ø  la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas.

Análisis de resultados

En este laboratorio específicamente se hace recuento o se cuantifica número de individuos por medio del método directo Cámara de recuento de Petroff-Hauser.

Una vez realizado el conteo se obtuvo el siguiente resultado:

Proteína:

Recuento 5:00 PM (x64) 3840

Recuento 6:50 AM (x64) 12800

Recuento 9:50 AM (x4) 152

Almidones.

Recuento 5:00 PM (x64) 2560

Recuento 6:50 AM (x64) 5120

Recuento 9:50 AM (x64) 3456

Celulosa.

Recuento 5:00 PM (x4) 44

Recuento 6:50 AM (x64) 384

GRUPO 9:25 AM                      

GRUPO 6:50 AM

             

GRUPO 5:00 PM

Recopilando los datos de recuento en cada estación horaria y correspondiente a cada grupo se obtiene automáticamente Nf, parámetro esencial para llevar a cabo la fórmula matemática que nos indicara el número de generaciones obtenidas.

Formulas

Nf = conteo x 1/dilución x voluen.

Nf = Ni x 2’n

Numero de generaciones obtenido.

Proteina.

Proteina
Tiempo	Población
5:00 PM	18,6
6:50 AM	23,6
9:50 AM	3,9

Se observa claramente un incremento en el primer tramo horario (5:00 PM), el cual sigue en crecimiento durante 13 horas aumentado generaciones en un 22% para el segundo tramo horario (6:50 AM), ya para el tercer y último tramo (9:50 AM), se destaca un descenso considerable del número de generaciones, se puede observar claramente en la siguiente gráfica.

Almidón.

Almidón
Tiempo	Población
5:00 PM	8,02
6:50 AM	9,03
9:50 AM	8,46

Se observa un incremento en el primer tramo horario (5:00 PM), el cual sigue en crecimiento durante 13 en un 12% para el segundo tramo horario (6:50 AM), ya para el tercer tramo (9:50 AM), se denota un descenso paulatino y no tan radical como ocurrió en la proteína, ratificando lo anterior la siguiente gráfica.

Celulosa

Celulosa
Tiempo	Población
5:00 PM	2,1
6:50 AM	5,2

Igual a lo visto anteriormente hay un crecimiento en el primer tramo horario y posterior aumento para el segundo tramo, pero esta vez diferenciándose en su alto desarrollo cercano al 40%; el último tramo horario correspondiente correspondiente a 9:50 AM no se pudo cuantificar por el método aplicado.

Para evaluar la actividad de celulasa, amilasa y proteasa producida por microorganismos eficientes previamente asilados, es necesario confrontar los resultados obtenido en los recuentos de cada tramo de hora y cada grupo, facilitando esta labor el apoyo en las gráficas realizadas anteriormente.

    

A pesar de no poder analizar el último tramo horario de la celulosa se podría estimar que los microorganismos eficientes previamente aislados generan una mejor actividad en celulosa ya que del primero al segundo tramo presento un crecimiento o aumento de generaciones en un 40%, siguiendo este mismo esquema la proteína igualmente tuvo un incremento considerable en los primeros tramos de un 22% pero un descenso drástico que podría interpretarse como poco aliento o sustrato para mantenerse con este buen aumento de generación en el tiempo, aspecto que si se puede observar en el Almidón, que a pesar de solo incrementar en los primeros tramos un 12% tiene un descenso  paulatino permitiendo durabilidad en el crecimiento de generaciones.